Študija in vrednotenje karcinogeneze

Kancerogenezo preučujemo z različnimi standardiziranimi toksikološkimi testi. Prvi del teh testov se izvede in vitro in - če so pozitivni - nadaljujemo s poskusi in vivo. Ta eksperimentalni pristop po korakih se imenuje PRISTOP TOČKE ODLOČBE, zaporedje preskusov, ki se končajo na koncu vsakega preskušanja, da se odločijo, kako nadaljevati s preskušanjem. Obstaja pet stopenj:

FAZA A: struktura in značilnosti rakotvorne spojine;

FAZA: v tej fazi kratkotrajnega in vitro testiranja se uporabljajo celice sesalcev. Najpogosteje uporabljene celice so hepatociti, ker se proučuje obseg sanacije škode, ki jo razvije hepatocit glede na resnost poškodbe, ki jo povzroči snov. Na kratko ne določimo škode same po sebi, ampak koliko sistema za popravilo je aktivirala jetrna celica.

Izveden postopek je oblikovanje 3 kultur hepatocitov. V prvi kulturi so hepatociti zdravi, v drugi so obdelani s preskusno snovjo in na koncu v tretji so obdelani s kontrolno snovjo, ki je zagotovo rakotvorna.Te tri kulture vsebujejo radioaktivno pirimidinsko bazo, ki je tritiran timidin, ki deluje kot marker.

Če preiskovana spojina povzroči mutacijo v DNA, se celica odzove na to težavo z aktiviranjem sistemov za popravilo. Košček DNK, ki je bil podvržen mutaciji, se razreže in zahvaljujoč delovanju DNA -polimeraze se manjkajoči del nadomesti z novim. Za korekcijo DNK -polimeraza uporablja nove baze, vključno s tritiranim timidinom. Vgrajena je radioaktivna baza. Analiza radioaktivnosti določa stopnjo mutacije v obdelanih celicah: večja kot je radioaktivnost, večje so mutacije DNA.

Tudi v fazi B se izvajajo testi na bakterijah, da se lahko preuči, ali obstajajo povratne mutacije. Uporabljene bakterije so že nosilci mutacij salmonele. Mutacija zadeva sintezo histidina, zato salmonele ne morejo rasti brez histidina. Te bakterijske kolonije se delno obravnavajo s preskusno snovjo, delno za negativno kontrolo in delno za pozitivno kontrolo, nato pa se preskusijo z znanim rakotvornim snovem. Če je ta preskusna snov posredna genotoksičnost, je treba v gojišče vnesti presnovne encime. Na tej točki bodo tri kulture posejane in gojene v petrijevih posodah (v gojišču ni histidina) .Če rakotvorne snovi, ki jih je treba preizkusiti, ni bilo nobene mutacije, teoretično na ploščah ne bi smelo biti nobene .Če je prišlo do mutagenega delovanja rakotvornega materiala, je morda spremenil prvo mutacijo in ustvaril drugo mutacijo, ki je sposobna gojiti bakterije na gojišču brez histidina. V tem primeru druga mutacija, ki spreminja prvo mutacijo in prevzame ime RETROMUTACIJA Končno, če pride do znatne rasti v piasta petri, je rakotvorna snov neposredna.
Vedno s testom in vitro je mogoče določiti kromosomsko celovitost. Ta test se vedno izvaja na celicah sesalcev in se uporablja za testiranje strupenih snovi, ki lahko povzročijo mutacije na nekaterih encimih, odgovornih za biosintezo DNK. Snov, ki jo je treba preskusiti je podvržen in vitro analizi. Da bi lahko ugotovili, ali preiskovana snov vpliva na celovitost in število prisotnih kromosomov, se uporabi mikronukleusni test. Mikrojedra so vezikli, ki nastanejo z delom kromatina v notranjosti. Kromatin, ki je vgrajen v te mikrojedre, je lahko bodisi cel kromosom ali fragment kromosomov. Mikrojedra nastanejo z napačno celično delitvijo, ki povzroča hčerinske celice z genskim materialom, ki ni enako Rezultat tega preskusa bo določitev snovi, ki so opredeljene za klastogene in vretenaste strupe. Klastogena snov proizvaja mikrojedra z osrednjimi drobci kromosomov, tako da snov povzroči prelom kromosomov, namesto tega strupena snov vretena proizvaja mikro jedra, ki so v njem, so prisotni celi kromosomi.
Če preiskovana snov v enem ali več preskusih povzroči genotoksičnost, je to opredeljeno kot zelo sumljivo, zato gre neposredno v fazo D. Če pa testirana snov nima genotoksičnega učinka, preide v fazo študije C, ker je lahko promotor.

FASEC: v tej fazi se lahko izvedejo testi in vitro in in vivo.

Za in vitro teste je bilo mogoče dokazati možnost, da promotorska snov prekine vrzeli med normalnimi celicami in tumorskimi celicami s posledičnim prehodom snovi med obe celici.

In vivo test je indukcija kožnih tumorjev pri miših. Snov, ki jo je treba preskusiti, nanesemo dvakrat ali trikrat na teden na kožo miši. Če je ta snov promotor, se lahko v 2/3 mesecih pojavijo papiloma. Pri miših se upoštevata dva glavna podatka: število miši, ki jih prizadenejo papilomi, in število papilomov, prisotnih na vsaki živali. Če snov deluje kot promotor in pri tumorju razvije tumor, to pomeni, da gre res za snov s promotorskim učinkom.

Ko so ti testi končani, preidemo na dolgoročne in vivo teste.

FASED: v tej fazi se testirajo vse spojine, ki se izkažejo za mutagene, in vse spojine, ki se ne izkažejo za mutagene. Preizkusi, ki jih je mogoče izvesti, so različni, med katerimi so nekateri testi na jetrih, pljučih in na koncu na dojki.

Jetrni test ne kaže na nastanek novonastalega tumorja, ampak na neoplastičnem žarišču, torej na nekaj, kar se pripravlja, da postane tumor. Celice tega žarišča so že atipične celice, zato so doživele mutacijo in se pripravljajo, da postanejo neoplastične celice. Po določenem času se zahvaljujoč obdukcijskemu pregledu določi nastanek pred neoplastičnih žarišč z izračunom števila in obsega teh pred neoplastičnih formacij.

Pljučni test omogoča določitev adenoma, ki je "anomalija celic pljučnega tkiva. Tudi v tem primeru se pljučno tkivo podgane pregleda po precej dolgem času (mesecih) (ti adenomi so zlahka prepoznavni, ker so belkasti vozlički na pljučnem epiteliju).
Test dojk omogoča določanje tumorjev v žleznem tkivu. Vedno se ocenjuje število nastalih adenomov in število živali z adenomi.

Če so rezultati teh testov pozitivni, je preskusna snov resnično rakotvorna. Na tej točki nadaljujemo z izvajanjem dragih testov z zelo dolgimi časi izvajanja.

FAZA: v tej fazi se dolgotrajno testira različno število živali, od 20 do 50. Ti testi so zelo dragi in za dosego določenih rezultatov potrebujejo veliko časa; govorimo o približno 1/8 življenja živali. Možno je, da med postopkom teh testov nekatere živali umrejo, vendar jih vedno preučujemo z obdukcijo in histološkim pregledom tipa. Izbrane živali so vedno podgane in miši in le 70-80% jih preživi do konca dolgotrajnih testov. Uporabljene živali so samo odstavljene, mlajše so, bolj občutljive so na zdravljenje. Med dolgoročnim testnim obdobjem raziskovalca vedno podpira matematik-statistik, ki lahko upošteva vse zbrane podatke in reproducira različne podatke.

Odmerki, preizkušeni na živalih, se začnejo od največjega dovoljenega odmerka in vseh njegovih podmnožic, ovrednoti pa se odziv na odmerek pri živalih.
Dajanje se mora vedno približati poti, po kateri lahko moški pride v stik s preiskovano snovjo, torej peroralno, kožno ali dihalno, medtem ko je pri preizkušanju rakotvornosti zdravila koristno tudi intravensko dajanje.
Testirane skupine živali so 4 (50 živali za vsako skupino):

Skupina NAIF, ki nima zdravljenja;
Skupina, obdelana z vozilom;
Skupina, obdelana s preskusno snovjo;
Skupina, zdravljena z znanim rakotvornim sredstvom.

Zelo pomembno je, da je število živali v vsaki skupini čim bolj enako. Pravzaprav, če je razlika v številu živali prevelika, se lahko statistični preizkus izkaže za lažen.
Ocene, ki se izvajajo, so:

Skupna pogostost tumorjev;
Pogostost nekaterih tumorjev;
Pogostost živali z več kot eno vrsto tumorja;
Število rakov pri živalih.

Na koncu vseh teh študijskih faz je snov razvrščena na lestvico IARC (Mednarodne agencije za raziskave in razvoj o raku) in Agencije za varstvo okolja (EPA).